Limb-Girdle Musküler Distrofi Tip 2E (LGMD2E) hastalığı için CRISPR-Prime Editing yöntemi kullanılarak preklinik moleküler tedavi geliştirilmesi
Proje Özeti
Limb-Girdle Musküler Distrofi (LGMD), iskelet kaslarını tutan, ilerleyici proksimal kas zayıflığı ile karakterize katılsal bir kas hastalığıdır.
LGMD hastalık grubu, kas zayıflığının dördüncü en yaygın sebebi olup hastalığın genel prevelansı 2.27-10/100.000’dır. LGMD çocukluk
veya erişkinlik çağında ortaya çıkmakta ve skapulohumeral ve/veya pelvifemoral kaslarda atrofi ile seyretmektedir. İlerleyen süreçte
hastaların hareketleri kısıtlanmakta ve yürüme yetileri tamamen kaybolmaktadır (Wicklund 2019). Hastalığın otozomal dominant
(LGMD1) ve otozomal resesif (LGMD2) kalıtımlı olarak aktarılan birçok tipi bulunmaktadır (Dincer, Leturcq et al. 1997, Dinçer, Akçören
et al. 2000, Balci, Wilichowski et al. 2004, Hara, Balci-Hayta et al. 2011, Taghizadeh, Rezaee et al. 2019). Otozomal resesif kalıtımlı
LGMD Tip 2E (LGMD2E), erken başlangıçlı ve nadir (0.86/10-6) bir LGMD tipi olup, beta-sarkoglikan (SGCB) genindeki mutasyonlar
sonucu ortaya çıkmaktadır (Fanin, Duggan et al. 1997, Dinçer, Akçören et al. 2000, Balci, Wilichowski et al. 2004, Guimarães-Costa,
Fernández-Eulate et al. 2021). Hastalık, şiddetli proksimal kas distrofisi ile karakterize olup hastaların yaklaşık yarısı 18 yaşından önce
yürüme yetisini kaybetmekte ve kardiyak tutulum göstermektedir (Semplicini, Vissing et al. 2015). LGMD2E için geliştirilmiş bir tedavi
henüz bulunmamaktadır, ancak preklinik aşamada başarı gösteren adeno-ilişkili virüs (AAV) aracılı beta-sarkoglikan gen aktarımı, faz
1/2 aşamasındadır (NCT03652259) (Pozsgai, Griffin et al. 2016, Pozsgai, Griffin et al. 2017). Bu çalışmalar, hastalığın gen tedavi
yöntemleriyle başarılı bir şekilde tedavi edilebileceğini önerse de AAV-aracılı gen aktarımının uzun vadede aşırı gen ifadesi sebebiyle
toksik etkiler oluşturabileceği gösterilmiştir (Van Alstyne, Tattoli et al. 2021). Bu sebeple, günümüzde hâlâ alternatif gen tedavi
metotlarına ihtiyaç duyulmaktadır. 2020 Nobel Kimya Ödülü’nün de verildiği metot olan CRISPR-Cas9-bazlı genom düzenleme
yöntemine dayanan hücre ve gen tedavi çalışmaları günümüzde gittikçe yaygınlaşmakta olup CRISPR teknolojisi kullanılarak
gerçekleştirilmiş hastalık tedavi çalışmaları ile ilgili umut verici veriler rapor edilmeye başlanmıştır (Xu, Wang et al. 2019, Frangoul,
Altshuler et al. 2020, Stadtmauer, Fraietta et al. 2020, Gillmore, Gane et al. 2021). Sunulan projenin amacı, LGMD2E hastalığına yol
açan mutasyonlardan birisi olan 32 baz çiftlik duplikasyonu (SGCB c.-22_10dup) taşıyan bir hasta bireyden elde edilerek oluşturulmuş
ölümsüz myoconverted fibroblast hücre hattında, CRISPR-Prime Editing yöntemi kullanılarak 32 bazın delesyonunun
gerçekleştirilmesiyle mutant allelin normal allele çevrilmesidir. Hastalık resesif kalıtımlı olduğundan hücrelerde tek bir allelin dahi
normal allele çevrilmesinin, beta-sarkoglikan ifadesini %50 artırarak kas işlevini iyileştirmek için yeterli olması beklenmektedir.
Miyotüplerde beta-sarkoglikan proteininin ifadesi ve yerleşimi western blot ve immünfloresan boyama yöntemleriyle incelenecektir.
CRISPR-Prime Editing ile muamele edilmiş hücreler, mutant ve kontrol grubu hücrelerle karşılaştırılıp genetik düzeltmenin protein
işlevine etkisi incelenmiş olacaktır. Çalışma, Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı laboratuvarında
gerçekleştirilecek olup araştırmada kullanılacak tüm teçhizat kurumumuzda mevcuttur. İş paketleriyle ilgili olası riskler ve bu risklerin
yönetimi proje dosyasında açıklanmıştır. Çalışmanın sonunda elde edilen veriler istatistiksel analizlerle değerlendirilecektir. Bu
çalışma ile, LGMD2E hastalığının tedavisine yönelik literatürde ilk defa genom düzenleme yöntemleri içinde en ileri teknolojilerden
biri olan CRISPR-Prime Editing metodu kullanılmış olacaktır (Anzalone, Randolph et al. 2019, Anzalone, Koblan et al. 2020, Matsoukas
2020). Ayrıca, bu çalışmadan elde edilen bilgiler LGMD2E hastalığının moleküler tedavisine yönelik in vivo çalışmalara öncü olacak
veriler sunacaktır
DİNÇER P. R. (Yürütücü), KURAL MANGIT E., GÜNTEKİN ERGÜN S.
2022 – 2023
