LGMD2A/R1 CRISPR/Cas9 Genom Düzenlemesi

200

Soyut

Çok sayıda Calpain 3 (CAPN3) mutasyonu, proksimal uzuv kaslarının seçici atrofisi ile çekinik uzuv-kuşak kas distrofisi (LGMD2A/LGMDR1) formlarına neden olur. Calpain 3 lokusunda (W130C, 550delA) ekson 3 ve ekson 4’te iki mutasyonu olan bir hastadan indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC) ürettik. Bu mutasyonları kurtarmak için iki farklı strateji tasarlandı: (i) LGMD2A-iPSC seviyesinde, CRISPR/Cas9 genom hedeflemesini FACS ve Tet transaktivatör tabanlı bir biallelik seçilim stratejisiyle birleştirdik ve bu da iki CAPN3 mutasyonu olmadan yeni bir işlevsel kimerik ekson 3-4 ile sonuçlandı. (ii) LGMD2A-iPSC türevi CD82+/Pax7+ miyojenik progenitör hücreler düzeyinde, oldukça yaygın ekson 4 CAPN3 mutasyonunun CRISPR/Cas9 aracılı kurtarılmasını gösteriyoruz. İlk strateji, hastalık modellemesi için özel olarak izogenik LGMD2A düzeltilmiş iPSC sağlar ve ikinci strateji, olası translasyonel yaklaşımlar için daha da geliştirilebilir.

Kaynak: https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC10653971/

Giriş

Kas distrofileri, iskelet kası hücrelerinin ekstraselüler matrisinde, plazma/nükleer membranında ve sarkomer/sitoplazmasında bulunan proteinlerdeki genetik değişikliklerden kaynaklanan otuzdan fazla iskelet kası genetik bozukluğunun heterojen bir grubunu oluşturur. Heterojenitelerine rağmen, distrofik fenotip, ilerleyen ve zamanla iskelet kası organizasyonunun tamamen dağılmasıyla sonuçlanan, hareketi destekleyemeyen bir başlangıçtaki kas zayıflaması ile karakterize edilir. Baskın iskelet kası zayıflığı dağılımına göre sınıflandırma, kas distrofilerini altı ana forma ayırır [ 1 ]. Bunlardan biri olan uzuv kuşağı kas distrofileri (LGMD’ler), otuzdan fazla alt tipi kapsar ve klinik olarak proksimal uzuv kaslarının seçici atrofisi ile ortaya çıkar. Kalıtım yoluna bağlı olarak LGMD tip 1 (dominant) ve LGMD tip 2 (resesif) olarak sınıflandırılırlar. Farklı alt tipler arasında yaş başlangıcı ve semptom şiddeti değişkenliğine rağmen, distrofik fenotip simetrik olarak proksimal uzuv kuşağı kaslarını etkiler. Başlangıçtaki zayıflık yavaşça ilerler ve zamanla kas kaybına yol açar ve sonunda vücut hareketlerini kısıtlar ve duruşta değişikliklere neden olur. Ek olarak, daha şiddetli alt tiplerde kalp ve solunum kasları etkilenir.

LGMD’ler arasında daha yüksek yaygınlığa sahip bir alt tip olan bacak-kuşak kas distrofisi tip 2A (LGMD2A), yapısal hücresel kompozisyondaki bir kusurdan değil, iskelet kasına özgü bir proteaz olan Kalpain 3’ün (CAPN3) bir kusurundan kaynaklanır [ 2 – 4 ]. İnsanlarda Kalpain 3 geni, 15. kromozomun uzun kolunda (15q15.1-q21.1) bulunur. CAPN3 lokusu, 53 kb’lik bir genomik bölgeye uzanan ve 3,5 kb’lik bir transkripte yol açan 24 ekzondan oluşur. Bugüne kadar, tüm diziyi kapsayan 280’den fazla patojenik mutasyon belgelenmiştir. Bunlar arasında en yaygın olanları, doğrudan II. bölgedeki enzim aktivitesini veya dolaylı olarak aktif bölgede katalitik üçlü oluşumunu etkileyen II. ve III. bölgelerdeki anlamsız mutasyonlardır [ 5 ]. Ek olarak, birkaç patojenik anlamsız mutasyon, Kalpain 3-titin bağlanmasını bozar [ 6 , 7 ]. Bu anlamsız mutasyonlar, yüksek oto-katalitik aktivitesi nedeniyle serbest formunda kararsız olduğu için Kalpain 3’ün stabilitesini etkiler [ 8 ].

Kalsiyum bağımlı 94 kDa’lık bir enzim olan kalpain 3, çözünür sistein proteazları grubuna aittir ve dört protein alanından oluşur [ 9 ]: prolin peptit alanı I, proteaz katalitik merkezi II, kalsiyum ve fosfolipid bağlama alanı III ve kalsmodulin benzeri Ca2+ bağlama alanı IV. CAPN3, diğer soylara kıyasla kaslarda en az on kat daha yüksek ifade ile iskelet kası dokusu ifadesi sergiler [ 10 ]. CAPN3’ün geleneksel kalpainlerin büyük alt birimine (50%) göre homolojisine rağmen, amino asit dizisinde önemli farklılıklar vardır [ 11 ]. Genel olarak, CAPN3’ün işlevi hala bilinmemektedir, ancak apoptozis, kas hücresi farklılaşması ve yeniden şekillenmesi, sarkomer oluşumu ve membran onarımı gibi biyolojik süreçlere katkısına dair çeşitli deneylerden ipuçları vardır. Baghdiguian ve ark. [ 12 ], CAPN3 eksikliğinin IkappaB alfa/NF-kappaB yolunun derin bozulması yoluyla miyonükleer apoptoza yol açtığını bildirmiştir. Maya iki hibrit haritalama denemeleri, CAPN3’ün sitoskeleton düzenlenmesi ve sarkomer yeniden şekillenmesi gibi süreçlerde CAPN3’ü konumlandıran iki titin bölgesine bağlandığını göstermiştir [ 13 ].

LGMB2B veya Miyoshi miyopatisi (disferlin mutasyonlarının neden olduğu otozomal resesif kas hastalıkları) olan hastalardan alınan biyopsiler ve in vivo fare çalışmalarından elde edilen sonuçlar, ek CAPN3 substratları, membran proteinleri veya membran onarım yollarında yer alan proteinleri önermektedir [ 14 ]. Koimmünopresipitasyon testleri, CAPN3 ve disferlinin plazma membranına tutunması yoluyla CAPN3 stabilizasyonuna yol açan biyokimyasal olarak etkileşime girdiğini kanıtlamaktadır [ 15 , 16 ]. CAPN3 eksikliği olan fare modelleri, bozulmuş membran bütünlüğü ile sunulmaktadır [ 17 ].

Hücre kültürü ve farelerdeki tüm bu yaklaşımların yanı sıra, kalpain-3’ün insan in vitro sistemlerindeki işlevini daha ayrıntılı olarak incelemek için yeterli miktarda hasta biyopsisi elde etmek zordur. Mevcut araştırma durumu, hasta hücrelerinin pluripotent kök hücrelere yeniden programlanmasına [ 18 ], genom düzenleme teknikleriyle izogenik hatların oluşturulmasına [ 19 ] ve pluripotent hatların hastaların genetik mutasyonlarını taşıyan çeşitli hücre soylarına farklılaştırılmasına [ 20 ] olanak tanır.

Çalışmamızda, bir LGMD2A hastasının fibroblastlarının indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC) yeniden programlanmasını ve hastanın her iki mutasyonunun iPSC düzeyinde CRISPR/Cas9 genom düzenlemesiyle kurtarılmasıyla izogenik bir kontrol hattının oluşturulmasını sunuyoruz ( Şekil 1(a) ). İkinci bir deney hattında, CD82+ iskelet kası progenitor hücrelerini bu LGMD2A iPSC’lerinden ayırıyoruz ve bu progenitor hücrelerde ekzon 4 CAPN3 mutasyonunun CRISPR/Cas9 aracılı kurtarılmasını gösteriyoruz. Bu sayede, bir LGMD2A distrofik hat ile izogenik formu arasında doğrudan bir karşılaştırma sunuyoruz; bu yaklaşım, CAPN3 etki mekanizmalarına dair daha fazla kanıt sağlayabilir.

“(a) Uzuv kuşağı kas distrofisi (LGMD2A) genetik düzeltmesini modellemek için indüklenmiş pluripotent kök hücreler ve genom düzenleme. CRISPR/Cas9 aracılı homoloji yönlendirilmiş onarım (HDR) insan LGMD2A iPS hücreleri düzeyinde kalpain-3 (CAPN3) lokusunda ve ardından vahşi tip (wt) iskelet kası hücrelerine farklılaşma (üst panel). CRISPR/Cas9 aracılı HDR, insan iPS türevi CD82+ iskelet kası progenitör hücreleri düzeyinde CAPN3 lokusunda (alt panel). (b) LGMD 2A hasta hiPS hücre hattında gen düzeltmesi gerçekleştirme stratejisi: CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi kullanılarak izogenik hattın üretilmesi için izlenen hedefleme stratejisini gösteren karikatür.”

Malzemeler ve Yöntemler

2.1. İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre (iPSC) Kültürü

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre (hiPSC) hatları, Kordon Kanı iPSC’si (CB CD34+, pasaj 15–35) [ 21 ], LGMD2A hasta iPSC’si (pasaj 5-25) ve izogenik LGMD2A Eksonları 3-4 düzenlendi (pasaj 2-13), Matrigel GFR- (Corning-) kaplı 6 kuyulu plakalarda TESR-E8’de (StemCell Technologies) kültüre edildi.

2.2. İnsan iPSC Üretimi

LGMD2A/R1 hasta materyali, Ruhr Üniversitesi Bochum Tıp Fakültesi etik komisyonundan etik onayı alındıktan sonra Bergmannsheil Üniversitesi Hastanesi’nde toplandı (15-5401, 08/2015). LGMD2A hastasından biyopsi olarak insan dermal fibroblastları (HDF’ler) alındı ve %10 fetal sığır serumu, penisilin ve streptomisin içeren yüksek glikozlu Dulbecco’nun modifiye Eagle ortamında büyütüldü. SFFV promotörünün kontrolü altında OCT4, SOX2, KLF4 ve c-MYC (OSKM) ve dtTomato’nun insan cDNA’larını kodlayan bir polisistronik lentiviral vektör daha önce açıklandığı gibi üretildi [ 21 – 23 ]. HDF’ler, 6 kuyulu bir plakanın kuyusu başına 1 × 10 ⁵ hücre olacak şekilde ekildi . Ertesi gün, hücreler konsantre OSKM lentivirüsü ile dönüştürüldü. Transdüksiyondan altı gün sonra, fibroblastlar tripsinizasyonla hasat edildi ve 6-kuyulu bir plakanın kuyusu başına 8 x 10 ⁴ hücre olacak şekilde mitomisin C ile işlenmiş STO besleyici tabakasına (Sigma-Aldrich, ABD) yeniden yerleştirildi. Ertesi gün, ortam %20 nakavt serum replasmanı (Invitrogen, ABD), 2 mM L-glutamin (Invitrogen, ABD), %1 esansiyel olmayan amino asitler (Invitrogen, ABD), 0,1 mM β -merkaptoetanol (Invitrogen, ABD), %1 penisilin/streptomisin ve 10 ng/ml bFGF (R&D) ile desteklenmiş DMEM/F12 (Invitrogen, ABD) ile değiştirildi. iPSC benzeri hücreler görünene kadar 50 μ g/ml C vitamini (Sigma-Aldrich, ABD) ve 0,5 mM valproik asit (VPA, Sigma-Aldrich, ABD) eklendi. Ortam her gün değiştirildi. Koloniler mekanik olarak toplandı ve mitomisin C ile tedavi edilen STO besleyici katmanlara transfer edildi.

2.3. İnsan iPSC Karakterizasyonu

2.3.1. Pluripotansiyel Belirteçler için İmmünohistokimya

Pluripotansiyel belirteçlerin immünositokimyasal boyama için, iPSC’ler oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %4 paraformaldehit ile sabitlendi. Hücreler %0,1 Triton X-100 ile permeabilize edildi ve ardından %1 sığır serum albümini (Amresco, Inc., ABD) ile bloke edildi. Boyama, birincil anti-Oct4 (1: 200, Santa Cruz, ABD), anti-Sox2 (1: 200, ThermoFisher Scientific, ABD), anti-SSEA4 (1: 200, Chemicon, MA, ABD) ve anti-Tra-1-60 (1: 200, Chemicon, MA, ABD) kullanılarak gerçekleştirildi.

2.3.2. İfade Profillemesi

Toplam RNA, üreticinin talimatlarına göre RNAeasy Micro Kit (Qiagen) kullanılarak iPSC hatlarından (LGMD2A, CB-CD34+) çıkarıldı. RNA bütünlüğü, RNA 6000 Pico kiti (Agilent) kullanılarak bir Agilent 2100 Bioanalyzer’da değerlendirildi. cDNA kütüphanesi, tüm transkriptom Illumina TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit Gold (Illumina) kullanılarak hazırlandı, ardından DNA 1000 kiti kullanılarak bir Agilent 2100 Bioanalyzer’da değerlendirildi. Elde edilen mRNA kütüphanesi, bir NextSeq 500 dizileyicide (Illumina) 2 × 75 bp eşleştirilmiş uç okumaları olarak dizilendi. Dizilenen okumalar, TopHat2 (sürüm 2.1.1) kullanılarak insan referans genomuna (hg38) hizalandı ve hizalanan okumalar, HTSeq-count (sürüm 0.11.2) kullanılarak mRNA ekspresyonunun ölçülmesinde kullanıldı. iPSC’ler, insan embriyonik kök hücre hatları H1 ve H9’un halihazırda mevcut transkriptomik veri kümeleriyle karşılaştırıldı.

2.3.3. Mikrodizi Karyotip Analizi

Hastadan alınan genomik DNA ve genomu düzenlenmiş (izogenik) LGMD2A pluripotent kök hücre hatları DNeasy kan ve doku kiti (Qiagen) kullanılarak saflaştırıldı. Örnekler, Illumina iScan teknolojisi ( https://www.lifeandbrain.com/produkte-services/lifeandbrain-genomics/ ) kullanılarak Bonn Üniversitesi Yaşam ve Beyin Genomik Tesisinde daha fazla işlendi .

2.4. LGMD2A iPSC’nin CRISPR/Cas9 Genom Düzenlemesi

2.4.1. CAPN3 Exon3 ve Exon4’te iPSC Düzeyinde Biallelik Seçim Stratejisi

Seçim kaseti sistemi, Calpain 3 lokusunun 1 kb uzunluğundaki homoloji kollarıyla çevrili plazmitlere dahil edildi. Üst homoloji kolu dizisi, Calpain 3 lokusunun ekson 3 {130Trp(TGG) > Cys(TGC)}’nin vahşi tip dizisine, sessiz bir mutasyonla (CTG > CTT) PiggyBac sisteminin ters terminal tekrarlarına (ITR’ler) karşılık gelen bir TTAA dizisi üretilebildiği noktaya kadar karşılık geliyordu. Bu TTAA dizisi, seçim kaseti için başlangıcı işaret ediyordu. Seçim kaseti sistemi, biri sürekli olarak aktif CAG promotörü altında ters tetrasiklin aktivatörü (rtTA) proteinini ifade eden ve diğeri tdTomato artı puromisin ifade eden ve diğeri indüklenebilir TRE-CMV promotörü altında ifade eden iki plazmitten oluşuyordu. Bu yaklaşım, ifade kasetleri arasında bağımlı bir döngü oluşturarak, yalnızca her iki plazmidin entegrasyonundan sonra kırmızı floresansın tespit edilebilmesini sağlar. Ek olarak, her iki alelin de PiggyBac aracılı eksizyon çıkarımı sırasında “seçim kasetlerinden arınmış” olduğundan emin olmak için, her iki plazmidin de sürekli olarak aktif bir promotör altında eGFP proteinini ifade etmesi gerekiyordu. PiggyBac sisteminin (TTAA) ters terminal tekrarları (ITR’ler) dizisi olan akış aşağı dizi, seçim sisteminin alt homoloji koluna karşılık geliyordu. Herhangi bir ek değişiklik yapmadan yeni kimerik ekzon 3/4 eksonunu oluşturmak için, alt homoloji kolunun dizisi, ara intron dizisini atlayarak, doğrudan EXON4 vahşi tip dizisi tarafından takip edilen ekzon 3 dizisinin geri kalanı arasında bir kimera idi. Ayrıca, CAS9 nükleazı tarafından tanıtılan seçilim kasetinde değişikliklerden kaçınmak için, kasetin PAM dizisi başka bir sessiz mutasyon (TTC > TTT) tanıtılarak mutasyona uğratıldı. Cas9 plazmidine (Addgene Plazmid #58766) tanıtılan gRNA dizisi 5′-TTT.GAT.CAT.GGG.GTA.TGA.CT-3′ idi. Ekson 3 ve ekson 4 bölgelerinde CAPN3 lokusunun genom düzenlemesini gerçekleştirmek için, Cas9 nükleazı ile birlikte seçilim kasetlerini içeren yapılar lipofektamin kök hücre transfeksiyon reaktifi (ThermoFisher Scientific) kullanılarak hücrelere iletildi. Transfeksiyondan sonra, düzenlenen popülasyon önce doksisiklin uygulaması üzerine 1 ug/ml konsantrasyonda puromisin (Sigma-Aldrich) seçilimi (0,5 ug/ml) ile zenginleştirildi ve ardından dtTomato-eGFP pozitif hücreler için ayırma yapıldı (BD Biosciences AriaII). Bu aşamada, CAPN3 lokusunun genomik bütünlüğü ve PiggyBac sisteminin ITR’lerinin genom üzerindeki varlığı, GXL Polimeraz (Clontech) kullanılarak düzenlenen alanların PCR amplifikasyonu ile değerlendirildi. Kasetin eksizyonu için hücrelere, hiperaktif PiggyBac transpozazının yalnızca eksizyon mutantını (R372A/K375A) taşıyan yapılar transfekte edildi [ 24 , 25] lipofektamin kök hücre transfeksiyon reaktifi kullanılarak. Transfeksiyondan sonra, negatif floresan hücreler FACS sıralaması ile seçildi ve ardından son doğrulama için genotipleme yapıldı. Kalpain-3 geninin ekzon3/4 bölgesinin amplifikasyonu için kullanılan primerler Exon3_FWD: TTCTCCTTCCCTGGGTTGAC ve Exon4_REV: CTCGGCTGGATTTTGCAACC idi.

2.4.2. Miyojenik Progenitor Hücreler Düzeyinde CAPN3 Ekson 3 ve 4’te Genom Düzenleme

Vektör pX260’ı (Addgene plazmidi #42229, [ 26 , 27 ]) barındıran Cas9 ve tek kılavuz RNA (sgRNA), LGMD2A iPS hücresinden türetilen iskelet kası progenitör hücrelerinde kromozom 15’teki (15q15.1) W130C ve 550delA CAPN3 mutasyonlarını düzenlemek için kullanıldı. sgRNA’lar, Hedef Bulucu Yazılımı (Feng Zhang Laboratuvarı, MIT, Cambridge, ABD, http://crispr.mit.edu ) kullanılarak CAPN3’ün 3 ve 4. eksonlarını hedefleyecek şekilde tasarlandı :

CAPN3 Ekson3: 5′-TCG.ATG.AAA.CTT.TGA.TCA.TGG.GGT.ATG.ACT-3′; CAPN3 Ekson4: 5′-GAC.TCT.GTG.CGT.GAC.GCT.TCT.GTG.CAG.TTC-3′.

Tavlanmış oligolar (CAPN3 Ekzon3 5′AAACTCGATGAAACTTTGATCATGGGGTATGACTGT3′+5′TAAAACAGTCATACCCCATGATCAAAGTTTCATCGA3′ veya CAPN Ekzon4 5′AAACGACTCTGTGCGTGACGCTTCTGTGCAGTTCGT3′+5′TAAAACGAACTGCACAGAAGCGTCACGCACAGTC3′) pX260’a bağlandı. Yabani tip nükleotid dizisini içeren 156 nt’lik tek zincirli bir DNA oligonükleotidi (ssODN) (Ekzon3: TCTGCCTGCAGGGGACTGCTGGTTTCTCGCAGCCATTGCCTGCCTGACCCTGAACCAGCACCTTCTTTTCCGAGTCATACCCCATGATCAAAGTTTCATCGAAAACTACGCAGGGATCTTCCACTTCCAGGTGAGGTAATGAGAGTGTAG; Ekzon4: GAGGAATGTGGAGGAAGGACACATTTCCTAACAGTAATTTGAGTATGTGACTCTGTGCGTGACGCTTCTGTGCAGTTCTGGCGCTATGGAGAGTGGGTGGACGTGGTTATAGATGACTGCCTGCCAACGTACAACAATCAACTGGTTTTC) homoloji yönlendirilmiş onarım (HDR) için şablon olarak kullanıldı. Vektör (1,5 μ g pX260- CAPN_exon3 veya 1,5 μ g pX260- CAPN_exon4) ve ssODN (1,5 μ g), üreticinin kılavuzuna göre transfeksiyon reaktifi olarak lipofektamin sapı kullanılarak iskelet kası progenitör hücrelerine kotransfekte edildi ( Bölüm 2.5.1 ). 2 μ g/ml puromisin eklenerek transfekte hücreler için seçimden sonra, ortaya çıkan tek hücreli koloniler daha fazla genişleme için 96 kuyulu plakalara aktarıldı. Genomik DNA izopropanol çöktürmesi ile hazırlandı ve başarılı HDR aracılı mutasyon düzeltmesi, CAPN3’ün ekzon 4 dizisinin PCR primerleri (5′-TGGGTCACTTTGTTCCTCCG-3′) ve (5′-GGCTGGATTTTGCAACCCAC-3′) kullanılarak amplifikasyonu ve vahşi tip CAPN3’ü mutant CAPN3’ten ayırmak için ardışık dizileme ile değerlendirildi.

2.4.3. sgRNA Hedef Dışı Analizi

CCTop-CRISPR/Cas9 hedef çevrimiçi tahmin programından [ 28 ] ( https://cctop.cos.uni-heidelberg.de/ ) hedef dışı tahmin modülünün potansiyel sgRNA hedef dışı etkilerini değerlendirmek için, maksimum, toplam uyumsuzluklar, çekirdek uzunluğu ve maksimum çekirdek uyumsuzlukları için varsayılan ayarlar uygulandı.

2.5. İskelet Kası Hücrelerine İn Vitro Farklılaşma

İki boyutlu bir kültür sisteminde iskelet kası farklılaşması Chal ve ark.’nın protokolüne göre gerçekleştirildi [ 29 , 30 ]. Kısaca, 0,9 × 10 ⁵ iPSC, ROCK inhibitörü içeren 12 kuyulu bir plakanın bir kuyusuna yerleştirildi. Ortam, yoğunluk yaklaşık %20 olana kadar her gün değiştirildi. Farklılaşma ortamı ve büyüme faktörü ardışık uygulamaları Chal ve ark.’ndan uyarlandı [ 30 ]. 23. günde, iskelet kası morfolojisi açıkça görülebilir ve hücreler miyojenik progenitörlerin FACS izolasyonu için kullanıldı.

2.5.1. Miyojenik Progenitor Hücrelerin FACS İzolasyonu

İki boyutlu kültür sisteminde farklılaştırılmış iskelet kası hücreleri TrypLe (Thermo Fisher Scientific, 12563011) kullanılarak ayrıştırılırken mekanik ayrışma her 15 dakikada bir gerçekleşti. 45 dakika sonra ayrışma durduruldu ve tek hücre süspansiyonu 40 μ m hücre süzgecinden filtrelendi. Hücre süspansiyonu %2 BSA ve 2 mM EDTA’da PE-anti-insan CD82 antikoru (BioLegend, 342103) ile boyandı ve FACS ayırıcı (Beckman Coulter, MoFlo Astrios Cellsorter) kullanılarak sıralandı. Kapılama için, 2 boyutlu farklılaştırılmış iskelet kası kültürlerinden boyanmamış tek hücreler temel kontrol olarak kullanıldı ve otofloresans dışlandı. FACS verileri Summit 6.3.1 kullanılarak yakalandı ve Beckman Coulter Inc.’den Kaluza Analysis 2.1 kullanılarak işlendi.

2.5.2. Miyojenik Progenitor Hücre Belirteçleri için scRNA-Seq Analizi

Referans veri seti olarak, Chal ve diğerlerinin protokolüne göre farklılaştırılmış iskelet kası progenitör/uydu benzeri hücrelerin profillerini çıkaran GSE149451 veri seti [ 31 ] kullanıldı. [ 29 , 30 ]. Seurat tabanlı normalizasyon için, SCT-dönüşüm yaklaşımı izlendi ( https://satijalab.org/seurat/ ; [ 32 , 33 ]). Seurat boru hattı sırasında dizileme derinliği, mitokondriyal transkriptlerin oranları, hücre döngüsü etkileri ve stresle ilişkili genler [ 34 ] geriletildi.

2.5.3. Miyojenik İşaretleyiciler için İmmünohistokimya

İskelet kası farklılaşma kültürleri, 2.5’teki gibi iki boyutlu kültür sisteminde farklılaşma indüksiyonundan sonra CD82-pozitif hücrelerin ayrılmasından sonra boyandı. 10.000 hücre, 10 dakika boyunca %4 paraformaldehit içeren THARMAC® Cellspin® I kullanılarak objektiflere sabitlendi. Hücreler PBS ile rehidrate edildi ve takip edildi ve PBS’de %0,1 (hacim/hacim) Triton-X100 ile bir kez permeabilize edildi. Ardından, hücreler oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS’de %5 BSA ile bloke edildi. Birincil antikor inkübasyonu 1 saat ve ikincil antikor inkübasyonu 1 saat boyunca gerçekleştirildi, her ikisi de oda sıcaklığında: birincil antikor: anti-PAX7 (DHSB, 1: 250); ikincil antikor: keçi anti-fare IgG (H+L) çapraz adsorbe edilmiş ikincil antikor, Alexa Fluor™ 488 (Thermo Fisher Scientific, 1: 1000). Görüntüler Zeiss LAM 800 ile alındı. Görüntüler Zen Lite Blue sürüm 4.0.3 kullanılarak işlendi.

2.6. Elektrofizyoloji

Mavrommatis ve diğerlerine göre [ 35 ], ilk farklılaşmadan sonra, elektrofizyolojik değerlendirme için LGMD2A iPSC, LGMD2A izogenik iPSC ve WT (CB) iPSC’den türetilen iskelet kası liflerinin daha fazla genişletilmesi, iskelet kası büyüme ortamında (PromoCell C-23060) gerçekleştirildi.

2.6.1. Akım Ölçümü

Membran akımları, standart tüm hücre yama kelepçesi yazılımı ISO2 (MFK, Niedernhausen, Almanya) kullanılarak ortam sıcaklığında (22-24 °C) ölçüldü. İskelet kası hücreleri, -90 mV’luk bir tutma potansiyelinde, yani EnAChR’ye negatif olarak voltaj kelepçelendi ve içeriye doğru Na+ akımları oluştu. Her 10 saniyede bir, -120 mV ile +60 mV arasında voltaj rampaları (süre 500 ms) uygulanarak kayıt koşullarının kararlılığı değerlendirildi ve I/V eğrileri oluşturuldu (depolarize edici voltaj rampalarına yanıt olarak membran akımları aşağı doğru sapmalar olarak gösterilmiştir). Sinyaller filtrelendi (köşe frekansı, 1 KHz), 1 KHz’de dijital olarak örneklendi ve voltaj kontrolü, veri toplama ve veri analizi için donanım/yazılım paketi ISO2 ile donatılmış bir bilgisayarda saklandı. Asetilkolin içeren bir çözeltiye hızlı maruziyet, yaklaşık 100 ms’lik bir yarı zaman ile tek bir hücrenin etrafındaki çözeltinin değiştirilmesine izin veren özel yapım solenoidle çalıştırılan bir akış sistemi vasıtasıyla gerçekleştirildi. Ölçümler için, komşu hücrelerle teması olmayan hücreler seçildi.

2.6.2. Floresan Mikroskobu ve Görüntüleme

[Ca2+]i’deki değişiklikleri izlemek için iskelet kası hücreleri geçici olarak pcDNA3[Twitch-2B] (Addgene, 49531) ( 35 mm kültür kabı başına 0,25 μ g) ile transfekte edildi [ 36 ]. İskelet kası hücreleri üreticinin talimatlarına göre polietilenimin (PEI) veya lipofektamin (Invitrogen) kullanılarak transfekte edildi. Deneylerden önce hücreler steril, poli-L-lizin kaplı cam kapak camlarına ekildi ve transfeksiyonlardan 48 saat sonra analiz edildi. Tüm deneyler ortam sıcaklığında tek hücreler kullanılarak gerçekleştirildi. Floresans, Zeiss yağ daldırma objektifi (100x/1.4), bir Polychrome V aydınlatma kaynağı ve CFP/YFP-FRET için uygun bir fotodiyot tabanlı çift emisyon fotometri sistemi (FEI Munich GmbH, Almanya) ile donatılmış ters bir mikroskop (Zeiss Axiovert 200, Carl Zeiss AG, Göttingen, Almanya) kullanılarak kaydedildi. FRET ölçümleri için, foto-ağarmayı en aza indirmek için tek hücreler değişken süreli ışık darbeleriyle (20 ms ila 50 ms; frekans: 5 Hz) 435 nm dalga boyunda uyarıldı. CFP’den (F480 veya FCFP) veya YFP’den (F535 veya FYFP) karşılık gelen yayılan floresans aynı anda elde edildi ve FRET, FYFP/FCFP oranı olarak tanımlandı. Floresan sinyalleri, ticari bir donanım/yazılım paketi (entegre D/A kartı ve Patch-master yazılımı olan EPC10 amplifikatörü, HEKA, HEKA Elektronik, Almanya) kullanılarak kaydedildi ve sayısallaştırıldı. Bireysel FRET izleri, agonist uygulamasından önceki başlangıç oran değerine (FRET/FRET0) göre normalize edildi.

2.6.3. Çözümler ve Kimyasallar

FRET ölçümleri için, aşağıdaki bileşime sahip hücre dışı bir çözelti kullanıldı (mmol/L): NaCl 137; KCl 5,4; CaCl2 2; MgCl2 1,0; HEPES/NaOH 10,0, pH 7,4. Membran akımlarının tüm hücre ölçümleri için, aşağıdaki bileşime sahip hücre dışı bir çözelti kullanıldı (mmol/L cinsinden): NaCl 120; KCl 20; CaCl2 0,5; MgCl2 1,0; HEPES/NaOH 10,0, pH 7,4. Pipet çözeltisi şunları içeriyordu (mmol/L cinsinden) K-aspartat 100; KCl 40; NaCl 5,0; MgCl2 2,0; Na2ATP 5,0; BAPTA 5,0; GTP 0,025; HEPES/KOH 20,0, pH 7,4. Standart kimyasallar Merck’ten alındı. EGTA, HEPES, Na2ATP, GTP ve asetilkolin klorür Sigma-Aldrich’ten temin edildi.

2.7. Kalpain-3 Western Blot Analizi

Bölüm 2.6’da özetlendiği gibi , LGMD2A iPSC’den, izogenik kontrollerinden, WT (CB) iPSC’den ve kas biyopsisinden farklılaştırılmış iskelet kas hücreleri , lizis tamponunda (4 M üre, 20 mM Tris-HCL (pH 8,5), DTT, _{MgCl2 ve %1 Triton-X-100) çözündürüldü ve daha sonra 5-8}μ g toplam protein/kuyu örneklerinde poliakrilamid jel elektroforezi ve Coomassie parlak mavisi (CBB) boyama ile açıklandığı gibi analiz edildi [ 37 ]. Proteinler, yarı kuru blot ile immünoblotlama için bir nitroselüloz membrana (Cytiva AmershamTM ProtranTM NC) aktarıldı. Birincil kalpain-3 antikoru (tavşan poliklonal, ab223766, Abcam Inc.) %3 BSA içeren PBS-T’de (1xPBS, %0,05 Tween-20) 1: 500 oranında seyreltildi ve blot 4°C’de bir gece boyunca pozlandı. İkincil antikor POD keçi α tavşan IgG (Sigma Inc.) %3 BSA içeren %0,05 PBS-T’de 1: 10,000 oranında seyreltildi ve bir saat boyunca oda sıcaklığında pozlandı. Kemilüminesan substrat (Radiance Q, Azure Biosystems, Dublin, CA, ABD) uygulandı ve görüntüler bir Azure 600 western blot görüntüleyicide (Azure Biosystems Inc.) yakalandı.

Sonuçlar

Çalışmamıza, biyopsi sırasında gevşek, atrofik ve proksimalde belirgin tetraparezi gösteren ve yalnızca destekle dengesiz bir şekilde ayakta durabilen 45 yaşında bir erkek hastayı dahil ettik. İlk semptomları 12 yaşında alt ekstremitelerde distal kontraktürler, sol taraflı ayak ucu yürüme ve pelvik kuşak kaslarında güçsüzlük ile başladı. 16 yaşında histopatolojik olarak dejeneratif miyopati teşhisi kondu. Hastalığın seyri sırasında kan kreatin kinaz (CK) düzeyleri orta derecede yüksekti (üst normal sınırın 2 ila 10 katı). Aynı yaşta, nörolojik muayenede gevşek, atrofik, proksimalde belirgin tetraparezi, bilateral skapula alata ve klinik karakterizasyonlarla eşleşen bilateral Trendelenburg ve Gower belirtilerinin hafif asimetrisi görüldü, Gallardo ve ark. [ 38 ]. Merdiven çıkma yeteneğinin kaybı 27 yaşında, sandalyeden kalkma yeteneğinin kaybı ise 33 yaş civarında meydana geldi. 40 yaşından beri hareketlilik için elektrikli tekerlekli sandalye kullanılıyor. Hastaya 33 yaşında, ekzon3’te Cys(TGC) yönünde bir Trp(TGG)130 nokta mutasyonu ve ekzon 4’te A550 nükleotidinin delesyonu için heterozigot olan kalpain-3 gen bileşiğinin tüm 24 ekzonu ve ekzon-intron geçişleri dizilenerek moleküler genetik olarak tanı konuldu. A550 delesyonu, Avrupa’da kalpain-3 geninin en yaygın mutasyonudur [ 39 ] ve protein sentezinin erken durmasıyla sonuçlanır. Ekzon3 mutasyonundan sisteine doğru değişim, büyük olasılıkla tam uzunluktaki proteinin protein konformasyonunu değiştirir. Bu W130C mutasyonu literatür araştırmalarımıza göre rapor edilmemiştir veya Leiden Musküler Distrofi sayfalarına © ( https://www.dmd.nl/ ) [ 4 ] kaydedilmemiştir.

CRISPR/Cas9 [ 26 , 40 , 41 ] kullanan genom düzenleme yaklaşımları, floresan protein katılımının (GFP ve RFP) genoma dahil edilmesi yoluyla başarılı biallelik olayların ayırt edilmesiyle daha da geliştirilmiştir [ 42 , 43 ]. Bu yaklaşımlara göre, biallelik olaylar çift GFP/RFP pozitif hücrelerin varlığıyla ayırt edilebilir. Daha sıkı bir seçilim süreci için, floresan sorgulamaya ek olarak, doksisiklinle indüklenebilir Tet-on sisteminin [ 44 ] başarılı biallelik olaylara sahip hücreleri seçmeye yardımcı olduğu bir sistem geliştirdik ( Şekil 1(b) ).

3.1. LGMD2A Hastası Tarafından Tetiklenen Pluripotent Kök Hücrelerde Kalpain-3 Lokusunda Biallelik Genom Düzenlemesi

Uzuv-kuşak kas distrofisi tip 2A’yı (LGMD2A) indüklenmiş pluripotent kök hücre türevi iskelet kas hücreleri ile modelleme ve aynı zamanda hücre hattı genetik geçmişinden kaynaklanan herhangi bir farklılığı dışlama girişimimizde, LGMD2A hastasından türetilen iPSC hattımızdan bir hiPSC izogenik hattı üretmeyi amaçladık (Şekil 1(a) ve 2 ). Bizim durumumuzda, hasta hattında iki mutasyon vardı, ekson3’te bir nokta mutasyonu (c.390: G > C) ve ekson4’te bir baz delesyonu (c.550delA) sırasıyla amino asit replasmanı ve erken sonlandırma kodonu oluşumundan sorumludur (Şekil 1(a) , 1(b) ve 3(c) ). İnsan iPSC hatlarında tek bir adımda biallelik modifikasyonlar gerçekleştirmek için mevcut protokollere [ 42 , 43 ] dayanarak , başarılı biallelik modifikasyonlara sahip hücreleri ayırt etmemize izin verecek bir strateji geliştirmeyi düşündük, aynı zamanda ara intronu atlayarak yeni bir işlevsel kimerik ekson 3-4 oluşturulabilir (Şekil 1(b) ve 3(a) ). Tüm biallelik olayları ayırt etmek için iki seçilim kaseti arasında bağımlı bir döngü oluşturmayı düşündük: bir seçilim kaseti, kurucu bir promotör altında Tet trans-aktivatörünü ifade ederken, diğeri Tet-CMV koşullu promotörü altında bir floresan proteini (tdTomato-kırmızı) ve bir seçilim ilacı (puromisin) ifade ediyor ( Şekil 1(b) ). Her iki kaset de kurucu olarak ifade edilen yeşil floresan proteini (eGFP) barındırır. Bu sistem, başarılı biallelik modifikasyondan sonra hücrelerin kırmızı/yeşil görüntülenmesine ve puromisin uygulamasından ve FACS ayırma yoluyla tam saflığa kadar saflaştırmadan sonra daha fazla zenginleştirmeye izin verir ( Şekil 4(b) ). Her iki kasetin de çıkarılması için, ITR dizileri seçim kasetlerini çevreledi ve bu da piggyBac transpozaz aracılı çıkarmaya izin verdi ( Şekil 4(c) ). Birkaç FACS ayırma deneyinde, çift pozitif ve ikinci adımda, piggyBac transpozaz transfeksiyonundan sonra, çift negatif hücre popülasyonları tanımlanabildi. Çıkarımı takiben, ara intronun tükenmesi Kalpain3 mRNA’sının bütünlüğünü etkilemedi ( Şekil 4(a) ). Ek olarak, karyotip bütünlüğü araştırması genom düzenleme sürecinden kaynaklanan herhangi bir değişikliği ortaya koymadı, böylece işlevsel bir izogenik hat doğrulandı ( Şekil 2(a) ). Kullanılan 5′-TTTGATCATGGGGTATGACT-3′ sgRNA için hedef dışı etkiler tahmininin çıktı dizilerinden, herhangi bir dizi değişikliği tespit edemediğimiz dizileme yoluyla ilk on isabeti olasılık açısından değerlendirdik (Ek Tablo 1). Son olarak, kalpain-3 ekspresyonunu değerlendiren Western blot analizi, LGMD2A iPSC ve izogenik karşılıkları için WT iPSC türevi iskelet kası hücrelerine benzer 94 kDa tam uzunlukta kalpain-3 protein bandını gösterdi (Ek Şekil 1 ).

“(a) Genom düzenlemesi sırasında genomik değişiklik olmadığını gösteren hasta ve izogenik LGMD2A hatlarından alınan karyogramlar. (b) Genom düzenlemesinden sonra LGMD2A iPSC’nin ve izogenik kontrol iPSC’nin pluripotent durumunu gösteren pluripotansiyel belirteçler Oct4, Sox2, SSEA4 ve TRA1-60 için immünositokimya. Ölçek çubukları 100 μ M. (c) H1 insan ESC ve LGMD2A iPSC, H9 insan ESC ve LGMD2A iPSC, CB iPSC ve LGMD2A iPSC ve H1 ve H9 insan ES hücreleri (soldan sağa) arasındaki küresel gen ekspresyon profillerini karşılaştıran saçılma grafikleri ve karşılık gelen Spearman korelasyonu. Analizler için H1 ve H9 insan ESC’leri GSE73211 veri setinden elde edildi.”

“(a) Tüm sessiz tanıtılan mutasyonları (TTT:TTC (Phe), CTG:CTT (Leu), EXON3’ten EXON4’e geçişi ve EXON3’teki kurtarmaları (130Cys(TGC-LGMD2A) > Trp(TGG-WT) ve EXON4: c.550delA) vurgulayan pirogramlarla birlikte yeni EXON3/4 CAPN3 konformasyonunu gösteren şema. (b) LGMD2AiPSC’den farklılaştırılmış iskelet kası progenitör hücrelerinin CD82+ FACS sınıflandırması: (i) boyanmamış iskelet kası popülasyonu (sol), (ii) %43,85 kapılı miyojenik progenitörler/uydu benzeri hücreler içeren farklılaştırılmış ve boyanmış iskelet kası hücreleri (orta) ve (iii) boyanmamış ve boyanmış popülasyonların kaymasının (kırmızı: boyanmamış kontrol; mavi: CD82 boyalı hücreler) (sağ) ve sitospin yoluyla plakalandıktan sonra CD82+ progenitör hücrelerinin PAX7 immünohistokimyasının görüntülenmesi. Pax7 (yeşil) ve DAPI (mavi). Ölçek çubuğu: 20 μ m (sağ). (c) LGMD2A iPSC farklılaşmış kas hücrelerinin exon3 390G > C CAPN3 lokusundaki (üst panel), exon4 550delA CAPN3 lokusundaki (orta panel) ve exon4 550delA CAPN3 lokusunun CRISPR/Cas9 gen düzeltmesinden sonraki (alt panel) genomik DNA’sından DNA dizileme elektroferogramları.”

“(a) Genom düzenlemesinden sonra çoğaltılmış kalpain-3 cDNA’sının dizileme diyagramı, ekzon3 ve ekzon4 arasındaki kesin füzyonu ve WT CAPN3 dizisine restorasyonu kanıtlıyor. (b) Bi-allelik modifikasyonlara sahip hücreleri ayırt etmek/elde etmek için FACS geçitleme stratejisi (tdTomato ve eGFP çift pozitif popülasyon). Sol alt panel: Çift pozitif ayırmadan sonra bir iPSC kolonisinin immüno floresan resmi. (c) Seçim kasetinin t çıkarılmasıyla hücreleri ayırt etmek/elde etmek için FACS geçitleme stratejisi (tdTomato ve eGFP çift negatif popülasyon). Sol alt panel: CAPN3 lokusundaki kaset eksizyonunun ve genomik DNA düzeyinde kimerik Ekzon3/4 üretiminin doğrulanmasının PCR’si (şerit “İzojenik LGMD2A”; PCR kontrol şeridi “hasta LGMD2A”).”

3.2. LGMD2A Hastadan Türetilen İskelet Kası Progenitör Hücrelerinde Kalpain-3 Lokusunda Genom Düzenleme

iPSC düzeyinde değil, LGMD2A hasta iskelet kası progenitör hücreleri üzerinde genom düzenlemesine izin veren bir protokol sağlama girişimimizde, 2D hücre kültürü protokolünde farklılaştırılmış insan iPSC’sinden CD82+ progenitör üzerinde CRISPR/Cas9 genom düzenlemesinin uygulanabilir olup olmadığını değerlendirmeye karar verdik [ 29 , 30 ]. Birkaç grup, en belirgin CD82+ ve CXCR4+/CD56+/CD29+ kombinasyonları arasında insan iskelet kası progenitör/uydu hücreleri için yüzey işaretleyici kombinasyonlarını tanımladı [ 45 – 47 ]. FACS, homojen alt popülasyonları heterojen popülasyonlardan, örneğin biyopsilerden veya in vitro farklılaştırılmış hücrelerden izole etmek için kullanılabilir. LGMD2A iPSC’lerini 23 gün boyunca farklılaştırdık ve miyoblastlardan ve miyositlerden ayrılan bir miyojenik progenitör popülasyonunu sıralamak için FACS’yi kullandık. Bu nedenle, daha önce açıklandığı gibi CD82 işaretlemesini kullandık [ 45 , 48 ]. Farklılaşma indüksiyonundan sonra 23. günde, LGMD2A türevi hücreler kültürde %44 CD82 pozitif hücre gösterdi ( Şekil 3(b) ), bu hücreler tek katmanlı kültür olarak plaka edilebilirdi. Yukarıdaki biallelik genom düzenlemesiyle üretilen bir kontrol deneyi LGMD2A-izogenik iPSC’de, türetilen progenitörler farklılaşmanın 23. gününde %49 CD82 pozitif hücre gösterdi. Plakalanmış CD82 pozitif popülasyonlar iskelet kası progenitörü/uydu hücre belirteci Pax7 için pozitiflik gösterdi ( Şekil 3(b) , Ek Şekil 2 ). İzole edilmiş ve kültürlenmiş miyojenik progenitörlerin/uydu benzeri hücrelerin daha ileri FACS analizi, tek hücre olarak kültürlendikleri sürece CD56’nın aşağı regülasyonuna işaret etti (veri gösterilmemiştir). Yaklaşık 125.000 hücre, yaklaşık 0,5 hücre/100 µl elde edilene kadar bir seyreltme serisinde seyreltildi ve ardından 96 kuyulu bir plakanın 96 kuyusuna aktarıldı. Bu plakadan, on koloni daha fazla genişletildi ve çoğaltıldı. On hücre hattının hepsinden genomik DNA izole edildi ve kalpain-3 lokusu ekson 3 ve ekson 4 alanları PCR ile çoğaltıldı. On hücre hattından ikisinde ekson 4 LGMD2A mutasyonunun vahşi tipe kurtarılması görüldü ( Şekil 3(d) ), bu klonların %20’sinde başarılı homoloji yönlendirilmiş onarıma karşılık gelmektedir. Ekson 3 W130C mutasyonunu düzelten hedefleme vektörü ve ssODN’leri ekledikten sonra genişletilen 96 hücre hattının aksine, ekson 3 mutasyonunun kurtarılması hatların hiçbirinde dizileme yapılarak doğrulanamadı.

3.3. LGMD2A iPSC ve İzojenik Kontrol iPSC Hatlarının İskelet Kası Farklılaşması ve Elektrofizyolojik Karakterizasyonu

LGMD2A iPS hücrelerinden miyofiberleri başarıyla desenledik ve fizyolojik özelliklerini araştırdık ( Şekil 5 ). LGMD2A hastası iskelet kası türevi hücrelerde nACHR’lerin işlevselliğini araştırmak için, tüm hücre konfigürasyonunda ACh kaynaklı akımları ölçtük. Temsili akım kaydıyla gösterildiği gibi, LGMD2A hastalarından alınan hücreler, zaman eşleştirilmiş LGMD2A izogenik hücreleri ve kontrol görevi gören WT iPS hücrelerine benzer şekilde asetilkoline yanıt verdi. Ancak, LGMD2A hastalarından alınan hücrelerde, muhtemelen LGMD2A fenotipi ile ilişkili hücre zarının kararsızlığından kaynaklanan akım dalgalanmaları ve tutma akımında hafif bir kayma sıklıkla gözlemledik ( Şekil 5(a) , sol panel). Bu sayede, hastamız ve karşılık gelen izogenik kontrol hatları, fizyolojik düzeyde LGMD2A iPSC tabanlı kas distrofisi modellemesinin temelini oluşturmaktadır.

“(a) LGMD2A hastasında, izogenik kontrolünde ve WT (kordon kanı) iPSC’den türetilen iskelet kas hücrelerinde ACh kaynaklı akımların temsili kayıtları ( n = 8 hücre). ACh (10 μ M), çubukla gösterildiği gibi uygulandı. Tutma potansiyeli -90 mV. Aşağı doğru sapmalar, -120 mV’den +60 mV’ye kadar depolarize edici voltaj rampalarına (süre 500 ms) yanıt olarak oluşan membran akımlarını temsil eder. Kesikli çizgi sıfır akım seviyesini gösterir. (b) LGMD2A iPSC’de, izogenik kontrolünde ve WT (kordon kanı) iPSC’den türetilen iskelet kas hücrelerinde özetlenmiş FRET kayıtları; ACh uygulaması sırasında [Ca2+]i’deki artışı izlemek için Twitch2B ile transfekte edilmiştir. (c) Farklılaşma indüksiyonundan 12. ve 40. günde LGMD2A iPSC türevi iskelet kası hücrelerinin morfolojisi (2D protokol) ölçek çubukları 100 μ M.”

Tartışma

İnsan iPSC’leri, disferlin ve alfa-sarkoglikan genlerindeki mutasyonlardan kaynaklanan LGMD2B ve 2D hastalarından [ 49 ] ve kalpain-3 geninin 17, 22 ve 24. eksonlarındaki mutasyonlardan kaynaklanan üç LGMD2A hastasından [ 50 ] üretildi ve CRISPR/Cas9 genomu düzenlendi.

Genel olarak, 3. ve 4. ekzonlarda kalpain mutasyonlarının yeni bir kombinasyonunu gösteren bileşik heterozigot bir hastanın LGMD2A iPSC’sini, yeni bir seçim stratejisiyle üretilen izogenik kontrol iPSC’sini eşleştiriyoruz ve ayrıca iskelet kası progenitör hücreleri düzeyinde CRISPR/Cas9 genom düzenlemesinin nasıl daha fazla gerçekleştirileceğine dair bir taslak sunuyoruz.

Genom düzenleme, gen nakavt hücre hatları elde etmek veya çeşitli amaçlar için spesifik mutasyonlar oluşturmak amacıyla hücrelerin genomunda diziye özgü değişiklikler yapmak için kullanılmıştır [ 20 ]. En güncel yaklaşımlar, başlangıçta yabancı DNA’ya karşı bakteriyel bağışıklık tepkisi olan RNA kılavuzlu bir endonükleaz olarak keşfedilen CRISPR/Cas9 nükleaz sistemini kullanır [ 40 ]. Daha sonra memeli genomlarının spesifik bölgelerinde çift sarmallı kırılmalara izin vermek için geliştirilmiştir [ 26 , 41 ]. CAS nükleazlarının uygulamaları, insan pluripotent kök hücrelerinde spesifik genomik bölgelerdeki çift sarmallı kırılmaların sıklığını %1 ve üzeri artırmıştır. Çift floresan seçilim stratejileriyle birleştirildiğinde, yüksek rekombinasyon frekanslarıyla biallelik genom modifikasyonları elde edilebilir [ 42 , 43 ].

Mandal ve diğerleri, CRISPR/Cas9’un insan CD34+ kan kök/progenitör hücrelerindeki genleri doğrudan devre dışı bırakmak için uygulanmasını genişletti [ 51 ]. Frontotemporal demans (FTD) hastası iPSC’lerinden farklılaştırılmış NPC’lerde TAU lokusunda verimli homologi yönlendirmeli onarım göstererek, bu genom düzenleme stratejilerinin sinir progenitör hücrelerini (NPC’ler) hedeflemedeki faydasını daha da genişlettik [ 20 , 52 ]. CRISPR/Cas9 sistem uygulamasından sonra NPC’lerde önemli homolog rekombinasyon frekansları elde edildi (%12 (3 düzenlenmiş/25 klon) insan CD34+ kök/progenitör hücrelerinde bildirilen yüksek CRISPR/Cas9 yönlendirmeli devre dışı bırakma frekanslarıyla (%27) uyumlu [ 51 , 52 ].

Bu raporda, CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi üzerine araştırmalarımızı iPSC’den türetilen iskelet kas hücrelerine genişletiyoruz. Prensip olarak, iPS hücresinden türetilen hücrelerin genom düzenlemesi (i) pluripotent kök hücreler düzeyinde ancak aynı zamanda (ii) bunlardan türetilen progenitör hücrelerde de verimli bir şekilde gerçekleştirilebilir ( Şekil 1 ).

Bu kavramları LGMD2A hasta biyopsimize uygulamak için, kalpain 3 lokusunda (W130C, 550delA) ekzon 3 ve ekzon 4’te iki mutasyona sahip hasta hattımızın spesifik genetik geçmişiyle karşı karşıya kaldık. Tek bir adımda iki farklı ekzonda genom düzenlemesi yapmanın engelini aşmak için, homoloji yönlendirmeli onarım (HDR) yolu sırasında ara intronu çıkararak ek bir delesyon oluşturmayı düşündük, çünkü CAPN3 geninin ORF’si intron-ekzon sınırlarıyla ilgili GT-AG kuralını izliyor gibi görünüyordu ( Şekil 1(b) ). Bir diğer zorluk da genom modifikasyonunun biallelik olması gerektiğiydi, çünkü LGMD2A otozomal resesif bir hastalıktı ve hasta hattımız bileşik heterozigottu. Bu nedenle, bu biallelik olayları ayırt etmek için, yalnızca biallelik olayların seçimini yönlendirecek donör şablonları arasında bağımlı bir döngü oluşturma fikrini ortaya attık. Bilgilerimize göre, raporumuz tek bir adımda silme, ekleme ve baz değişimini içeren CRISPR/Cas9 genom düzenlemesinin ilk kez bir açıklamasıdır ( Şekil 3(a) ). Genomik bütünlük hala korunmaktadır ( Şekil 2 ).

Arias-Fuenzalida ve ark. [ 42 ] ve Eggenschwiler ve ark. [ 43 ] tarafından insan iPSC hatlarında tek bir adımda biallelik modifikasyonlar gerçekleştirmek için özetlenen kavramlara dayalı olarak , yaklaşımımızın genel tasarımı genom düzenleme için zahmetli nicelemelerden kaçınır. Yaklaşım bağımsız olarak etkilidir, çünkü başarılı bir şekilde biallelik düzenlenmiş klonlar iki adımlı bir stratejide seçilip genişletilir. Bu nedenle, ilk olarak, FACS biallelik modifikasyonları hedeflemek ve izole etmek için bir muhabir GFP/RFP sistemi tanıttık ve ikinci olarak, aynı hücre içinde her iki plazmidin varlığına daha fazla bağlı olan başarılı biallelik olayları seçmek için indüklenebilir (TRE-doksisiklin) bir puromisin direnç kaseti tanıttık. Kaseti çıkardığımızda olduğu gibi, düzenlenen hücrelerde ikili muhabir sisteminin olmaması, FACS sıralama yoluyla genom düzenlenmiş hücreleri tanımlamamıza ve elde etmemize yardımcı olur.

Yaklaşımımızın olası bir dezavantajı, ekson 3 ve ekson 4 arasındaki introndaki olası düzenleyici dizilerin veya alternatif ekleme sinyallerinin düzenlemeden sonra atlanabilmesidir. Western blot analizindeki kalpain-3 bantları, LGMD2A iPSC, bunların izogenik hattı ve diğer kontroller arasında aynı şeyi sunar (Ek Şekil 2 ). Hastamızın bileşik heterozigotluğu, büyük olasılıkla değiştirilmiş bir konformasyona sahip ekson3 nokta mutasyonuna sahip alelden tam uzunlukta bir kalpain-3 proteini ile kendini ayırır. Bu nedenle, bu hastaların iPSC’den türetilen iskelet hücreleri ve izogenik karşılıkları ile kontrol hücreleri arasında da eşit bir bantlama beklenebilir. Western blotting kullanıldığında normal miktarda kalpain-3 proteininin gözlenmesi, yaklaşık %20’sinin normal kalpain-3 protein miktarlarına sahip olduğu 58 LGMD2A hastasından oluşan bir kohortta incelenmiştir [ 53 ].

İkinci düzenleme yaklaşımımız için, belirli genetik ve yüzey molekülü belirteç kombinasyonları tarafından profillendiği öne sürülen miyojenik progenitör hücreleri hedefliyoruz [ 29 , 54 – 58 ]. CD56 veya CD82 gibi yüzey belirteçlerinin kombinasyonu ile FACS seçimi çeşitli gruplar tarafından tanıtılmıştır, buna göre CD82+ tek bir miyojenik progenitör belirteci olarak sunulmaktadır [ 45 – 47 ]. Chal ve diğerlerine göre [ 29 ] iPSC’den farklılaşan insan CD82+ progenitör hücrelerinin ayrıca uydu hücre belirteçleri Pax7, Myf5 ve MyoD1’i de birlikte ifade ettiğini gösteren bir silico scRNAseq analizi sağlıyoruz (Ek Şekil 1 ).

Bu CD82+ sıralı progenitör popülasyonlarında ekzon 4 550delA mutasyonunu %20’lik bir sıklıkta düzenleyebildik. Buna karşılık, ekzon 3 W130C mutasyonunun düzenlenmesi 96 genişletilmiş satırda başarılı olmadı. Sinir progenitör hücrelerinde TAU lokusunda genom düzenlemeyle ilgili önceki CRISPR/Cas9 deneyimlerimizde %12’lik bir sıklığa ulaşmıştık [ 52 ]. Bazı genomik tarafların CRISPR/Cas9 aracılı kesmeye daha dirençli veya takip eden HDR onarım sürecine daha dirençli olduğunu ve bunun da başarılı düzenlemenin farklı sıklıklarıyla sonuçlandığını tahmin edebiliriz. LGMD2A hastamızda ekzon 3 ve ekzon 4’teki iki mutasyonla ilgili bileşik heterozigotluk vardı, dolayısıyla ekzon 4 mutasyonuna sahip alel üzerindeki lokus, ekzon 3 mutasyonuna sahip diğer alele göre tek zincirli DNA oligonükleotid yaklaşımıyla düzenlemeye daha açık ve izin verici olabilirdi.

LGMD iPSC ve progenitör hücreler düzeyindeki her iki yaklaşımımız da Avrupa’nın en yaygın kalpain-3 ekzon 4 550delA mutasyonunu kurtarmak için makul frekanslarda HDR’ye izin verdi. LGMD iPSC düzeyinde hedeflemeye yönelik ilk yaklaşımımız, otolog hasta iPSC’sini üretme sürecinin karmaşıklığı ve GMP (iyi üretim uygulaması) uyumlu bir süreçte daha fazla düzenleme göz önüne alındığında insan hücresel terapileri için gerçekten öngörülemez. Bu yeni LGMD2A iPSC serisini ve izogenik kontrolünü öncelikle daha fazla hastalık modellemesi için bir kaynak olarak sunuyoruz.

Hasta materyalinden yüzey belirteci temel alınarak miyojenik progenitör hücrelerin izolasyonu hızla ilerlemektedir [ 45 – 47 , 59 ]. Mevcut çalışmalar, bu progenitör/uydu benzeri hücrelerin in vitro nasıl çoğaltılabileceğine dair bilgimizi genişletmektedir [ 29 , 31 , 35 ]. Bu öncül popülasyonların hasta hücrelerinden FACS ile izole edildiği, çoğaltıldığı, epizomal CRISPR/Cas9 düzenleme plazmitleri ve ssODN’ler kullanılarak kısa bir kültür periyodu içinde kısaca düzenlendiği ve daha sonra belirli bir iskelet kası alanını yeniden doldurmak için geri infüze edildiği bir süreç öngörüyoruz. CRISPR/Cas9 sisteminin kas distrofileri için şu anda tartışılan translasyonel uygulamalarına tamamlayıcı olarak [ 60 ], LGMD2A hasta kaynaklı iskelet kası progenitör hücrelerinde düzenlemenin başarılı bir örneğini buraya ekliyoruz. Farklılaşmış iskelet kaslarında HDR’nin hala zorlu olması nedeniyle, CD82/Pax7 pozitif hedef popülasyonlarının kas distrofisi bağlamında CRISPR/Cas9 aracılı düzenleme için translasyonel potansiyeli olabilir.

Sonuç

Burada, bacak kuşağı kas distrofisi olan bir hastadan başarıyla indüklenmiş pluripotent hücreler ürettik ve hastalığa özgü genomik mutasyonları kurtarmak için iki strateji geliştirdik: (i) LGMD2A-iPSC düzeyinde, CRISPR/Cas9 genom hedeflemesini FACS ve Tet transaktivatörüne dayalı biallelik seçilim stratejisiyle birleştirdik ve bu da iki CAPN3 mutasyonu olmadan yeni bir işlevsel kimerik ekzon 3-4 ile sonuçlandı. (ii) LGMD2A-iPSC’den türetilen CD82+/Pax7+ iskelet kası progenitör hücreleri düzeyinde, oldukça yaygın bir ekzon 4 CAPN3 mutasyonunun CRISPR/Cas9 aracılı kurtarılmasını gösterdik. İlk strateji, hastalık modellemesi için özel olarak izogenik LGMD 2A/R1 düzeltilmiş iPSC sağlar ve ikinci strateji, olası translasyonel yaklaşımlar için daha da geliştirilebilir.

Teşekkürler

Çalışmamız Ruhr Üniversitesi Bochum Tıp Fakültesi FoRUM (F873-16); Deutsche Gesellschaft für Muskelkranke eV (DGM Vakfı); ve Deutsche Duchenne Stiftung, Duchenne Deutschland eV Teknik yardımları için Ruhr Üniversitesi Bochum Anatomi Enstitüsü’nden Rana Houmany ve Boris Burr’a ve Heimer Institut für Muskelforschung, Universitätsklinik Bergmannsheil’den Janine Mertens-Rill ve Anja Schreiner’e teşekkür ederiz. Ayrıca PiggyBac transpozaz ekspresyon vektörünü sağladığı için Max Planck Enstitüsü Münster’den Dr. Kenjiro Adachi’ye, pcDNA3[Twitch-2B] plazmidini sağladığı için Dr. Oliver Griesbeck’e, SF-OSKM yeniden programlama vektörü için Prof. Axel Schambach, MHH Hannover’a minnettarız. ve RNAseq dizilemesini desteklediği için Prof. Ralf Adams’a teşekkür ederiz. Ayrıca, FACS Tesisi, Max Planck Moleküler Biyomedikal Enstitüsü, Münster’den Dr. Martin Stehling’e ve FACS Tesisi, Tıp Fakültesi, Ruhr’dan PD Dr. Marcus Peters ve Petra Bonowitz’e teşekkür ederiz. Bochum Üniversitesi.

Veri Kullanılabilirliği

Bu çalışmada üretilen RNA dizileme veri kümeleri, GSE147513 erişim kodu altında Gen İfade Omnibus’a (GEO) yüklenmiştir ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE147513 ).

Çıkar Çatışmaları

Yazarlar bu makalenin yayınlanmasıyla ilgili herhangi bir çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Yazarların Katkıları

LM deneyleri tasarladı ve gerçekleştirdi, verileri analiz etti ve makaleyi yazdı. AZ deneyleri tasarladı ve gerçekleştirdi, verileri analiz etti ve makaleyi düzenledi. UK ve JD deneyleri tasarladı ve gerçekleştirdi. MCK elektrofizyolojiyi tasarladı, gerçekleştirdi ve analiz etti. HWJ toplu RNAseq analizini gerçekleştirdi. PB çalışma materyallerini ve klinik tanıyı sağladı. BBS çalışma materyallerini sağladı ve çalışmayı denetledi. MV çalışma materyallerini ve hasta ve sağlıklı biyopsileri sağladı ve çalışmayı denetledi. HZ deneyleri tasarladı, verileri analiz etti, çalışmayı denetledi ve makaleyi yazdı.

Ek Malzemeler

Ek 1Ek Şekil 1: LGMD2A, LGMD2A izogenik ve WT iPSC türevi iskelet kas hücrelerinin western blot analizi ve 94 kDa kalpain-3 bandını ve onun bozunma ürünlerini gösteren kas biyopsileri. Şeklin alt kısmı: Blotlamadan önce Coomassie boyama.

Ek veri dosyası için buraya tıklayın. ^{(62.7KB, pdf)}

Ek 2Ek Şekil 2: CD82+ progenitör hücrelerinin genom düzenlemesinde kullanılan iki boyutlu farklılaşma protokolüne göre insan iPSC’lerinden farklılaştırılmış iskelet kası progenitör hücrelerinin yüzey belirteci CD82, uydu hücre belirteci PAX7, MYF5 ve MYOD1 ile miyojenik belirteçler MYOG ve MYH3’ün göreceli ifadesini tahmin eden UMAP özellik çizimleri [ 29 , 31 ].

Ek veri dosyası için buraya tıklayın. ^{(146.3KB, pdf)}

Ek 3Ek Tablo 1: ccTOP CRISPR/Cas9 hedef çevrimiçi tahmin programı ve dizilemeden önce genomik bölgeyi çoğaltmak için kullanılan primerler kullanılarak 5′-TTTGATCATGGGGTATGACT-3′ sgRNA dizisinin tahmin edilen hedef dışı etkileri.

Ek veri dosyası için buraya tıklayın. ^{(192.4KB, pdf)}

Referanslar

1.Emery AEH Kas distrofileri. BMJ . 1998;317(7164):991–995. doi: 10.1136/bmj.317.7164.991. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
2.Jenne DE, Kley RA, Vorgerd M., ve diğerleri. Kalpain 3’ün alternatif olarak eklenmiş IS2 bölgesinde homozigot Ser606Leu mutasyonu olan bir kardeş çiftinde bacak kuşağı kas distrofisi. Biyolojik Kimya . 2005;386(1):61–67. doi: 10.1515/BC.2005.008. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
3.Richard I., Broux O., Allamand V., ve diğerleri. Proteolitik enzim kalpain 3’teki mutasyonlar bacak-kuşak kas distrofisi tip 2A’ya neden olur. Hücre . 1995;81(1):27–40. doi: 10.1016/0092-8674(95)90368-2. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
4.Richard I., Roudaut C., Saenz A., ve diğerleri. Kalpainopati–mutasyonlar ve polimorfizmlerin bir araştırması. Amerikan İnsan Genetiği Dergisi. 1999;64(6):1524–1540. doi: 10.1086/302426. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
5.Jia Z., Petrounevitch V., Wong A., ve diğerleri. Uzuv kuşağı kas distrofisine bağlı kalpain 3’teki mutasyonlar: moleküler modelleme ve m-kalpain mutasyonuyla analiz. Biyofizik Dergisi. 2001;80(6):2590–2596. doi: 10.1016/S0006-3495(01)76229-7. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
6.Kramerova I., Kudryashova E., Tidball JG, Spencer MJ Farelerde kalpain 3’ün (p94) null mutasyonu in vivo ve in vitro anormal sarkomer oluşumuna neden olur. İnsan Moleküler Genetiği . 2004;13(13):1373–1388. doi: 10.1093/hmg/ddh153. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
7.Ono Y., Shimada H., Sorimachi H., ve diğerleri. Uzuv kuşağı kas distrofisi tip 2A ile ilişkili mutasyonların neden olduğu kas-spesifik bir kalpain olan p94’ün fonksiyonel kusurları. Biyolojik Kimya Dergisi. 1998;273(27):17073–17078. doi: 10.1074/jbc.273.27.17073. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
8.Ono Y., Shindo M., Doi N., Kitamura F., Gregorio CC, Sorimachi H. CAPN3/p94/kalpain-3’ün N- ve C-terminal otolitik parçaları, moleküller arası tamamlama yoluyla proteolitik aktiviteyi geri kazandırır. Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Bilimler Akademisi Bildirileri. 2014;111(51):E5527–E5536. doi: 10.1073/pnas.1411959111. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
9.Goll DE, Thompson VF, Li H., Wei W., Cong J. Kalpain sistemi. Fizyolojik İncelemeler. 2003;83(3):731–801. doi: 10.1152/physrev.00029.2002. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
10.Sorimachi H., Imajoh-Ohmi S., Emori Y., ve diğerleri. Hem m- hem de μ-tiplerinden farklı yeni bir memeli kalsiyum bağımlı proteazının moleküler klonlanması: iskelet kasında mRNA’nın spesifik ifadesi. Biyolojik Kimya Dergisi . 1989;264(33):20106–20111. doi: 10.1016/S0021-9258(19)47225-6. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
11.Sorimachi H., Kimura S., Kinbara K., ve diğerleri. Yaygın ve dokuya özgü kalpain türlerinin yapısı ve fizyolojik işlevleri: kas özgü kalpain, p94, bağlantı/titin ile etkileşime girer. Biyofizikteki Gelişmeler. 1996;33:101–122. doi: 10.1016/0065-227X(96)81667-4. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
12.Baghdiguian S., Martin M., Richard I., ve diğerleri. Kalpain 3 eksikliği, miyonükleer apoptozis ve bacak-kuşak kas distrofisi tip 2A’da IκBα/NF-κB yolunun derin bozulmasıyla ilişkilidir. Nature Medicine. 1999;5(5):503–511. doi: 10.1038/8385. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
13.Kinbara K., Sorimachi H., Ishiura S., Suzuki K. Kas-spesifik kalpain, p94, iki immünoglobulin C2 motifiyle çevrili benzersiz bir bölge olan bağlantının uç C-terminal bölgesiyle etkileşime girer. Biyokimya ve Biyofizik Arşivleri. 1997;342(1):99–107. doi: 10.1006/abbi.1997.0108. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
14.Anderson LV, Harrison RM, Pogue R., ve diğerleri. Uzuv kuşağı kas distrofisi tip 2B ve Miyoshi miyopatisi (birincil disferlinopatiler) olan hastalarda kalpain 3 ekspresyonunda sekonder azalma Nöromüsküler Bozukluklar . 2000;10(8):553–559. doi: 10.1016/S0960-8966(00)00143-7. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
15.Huang Y., Verheesen P., Roussis A., ve diğerleri. Faj gösterimiyle seçilen lama türevi antikor parçaları kullanılarak disferlinopati hastalarında protein çalışmaları. Avrupa İnsan Genetiği Dergisi. 2005;13(6):721–730. doi: 10.1038/sj.ejhg.5201414. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
16.Kramerova I., Kudryashova E., Venkatraman G., Spencer MJ Calpain 3, ubiquitin-proteazom yolunun yukarı akışında hareket ederek sarkomer yeniden şekillenmesine katılır. İnsan Moleküler Genetiği . 2005;14(15):2125–2134. doi: 10.1093/hmg/ddi217. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
17.Richard I., Roudaut C., Marchand S., ve diğerleri. Kalpain 3 proteolitik aktivitesinin kaybı, farelerde kas distrofisine ve apoptozla ilişkili IkappaBalpha/nükleer faktör kappaB yolu bozulmasına yol açar. Hücre Biyolojisi Dergisi. 2000;151(7):1583–1590. doi: 10.1083/jcb.151.7.1583. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
18.Park IH, Arora N., Huo H., ve diğerleri. Hastalığa özgü uyarılmış pluripotent kök hücreler. Hücre . 2008;134(5):877–886. doi: 10.1016/j.cell.2008.07.041. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
19.Sterneckert JL, Reinhardt P., Schöler HR Kök hücre modelleri kullanılarak insan hastalıklarının araştırılması. Nature Reviews Genetics . 2014;15(9):625–639. doi: 10.1038/nrg3764. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
20.Zaehres H. İndüklenmiş pluripotent kök hücreler. İçinde: Brand-Saberi B., editör. Kök hücre biyolojisindeki temel güncel kavramlar. Biyolojik Bilimlerde Öğrenme Materyalleri. Springer, Şampiyonlar; 2020. [ DOI ] [ Google Akademik ]
21.Dorn I., Klich K., Arauzo-Bravo MJ, ve diğerleri. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücrelerinin eritroid farklılaşması, donör hücre kökeninin türünden bağımsızdır. Haematologica. 2015;100(1):32–41. doi: 10.3324/haematol.2014.108068. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
22.Warlich E., Kuehle J., Cantz T., ve diğerleri. Hücresel yeniden programlamanın erken aşamalarını görselleştirmek için lentiviral vektör tasarımı ve görüntüleme yaklaşımları. Moleküler Terapi. 2011;19(4):782–789. doi: 10.1038/mt.2010.314. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
23.Zaehres H., Kim JB, Schöler HR İndüklenmiş pluripotent kök hücreler. Enzimoloji Yöntemleri. 2010;476:309–325. doi: 10.1016/S0076-6879(10)76018-3. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
24.Li X., Burnight ER, Cooney AL, ve diğerleri. piggyBac transpozaz araçları genom mühendisliği için. Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Bilimler Akademisi Bildirileri. 2013;110(25):E2279–E2287. doi: 10.1073/pnas.1305987110. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
25.Yusa K., Zhou L., Li MA, Bradley A., Craig NL Memeli uygulamaları için hiperaktif bir piggyBac transpozazı. Amerika Birleşik Devletleri Ulusal Bilimler Akademisi Bildirileri. 2011;108(4):1531–1536. doi: 10.1073/pnas.1008322108. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
26.Cong L., Ran FA, Cox D., ve diğerleri. CRISPR/Cas sistemlerini kullanarak çoklu genom mühendisliği. Science . 2013;339(6121):819–823. doi: 10.1126/science.1231143. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
27.Ran FA, Hsu PD, Wright J., Agarwala V., Scott DA, Zhang F. CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak genom mühendisliği. Nature Protocols . 2013;8(11):2281–2308. doi: 10.1038/nprot.2013.143. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
28.Stemmer M., Thumberger T., del Sol Keyer M., Wittbrodt J., Mateo JL CCTop: sezgisel, esnek ve güvenilir bir CRISPR/Cas9 hedef tahmin aracı. PLoS One . 2015;10(4, makale e0124633) doi: 10.1371/journal.pone.0124633. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
29.Chal J., Oginuma M., Al Tanoury Z., ve diğerleri. Duchenne kas distrofisini modellemek için pluripotent kök hücrelerin kas liflerine farklılaştırılması. Nature Biotechnology . 2015;33(9):962–969. doi: 10.1038/nbt.3297. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
30.Chal J., Al Tanoury Z., Hestin M., ve diğerleri. İnsan pluripotent kök hücrelerinden insan kas lifleri ve uydu benzeri hücrelerin in vitro üretimi. Nature Protocols . 2016;11(10):1833–1850. doi: 10.1038/nprot.2016.110. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
31.Al Tanoury Z., Rao J., Tassy O., ve diğerleri. İnsan PAX7 pozitif miyojenik öncüllerinin/uydu hücre soyunun in vitro farklılaşması. Geliştirme . 2020;147(12, makale dev187344) doi: 10.1242/dev.187344. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
32.Hao Y., Hao S., Andersen-Nissen E., ve diğerleri. Çok modlu tek hücreli verilerin entegre analizi. Hücre . 2021;184(13):3573–3587.e29. doi: 10.1016/j.cell.2021.04.048. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
33.Satija R., Farrell JA, Gennert D., Schier AF, Regev A. Tek hücreli gen ifadesi verilerinin mekansal yeniden yapılandırılması. Nature Biotechnology . 2015;33(5):495–502. doi: 10.1038/nbt.3192. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
34.van den Brink SC, Sage F., Vértesy Á., ve diğerleri. Tek hücre dizilemesi, doku alt popülasyonlarında ayrışma kaynaklı gen ifadesini ortaya koyuyor. Nature Methods . 2017;14(10):935–936. doi: 10.1038/nmeth.4437. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
35.Mavrommatis L., Jeong H.-W., Kindler U., ve diğerleri. İnsan iskelet kası organoidleri fetal miyogenezi modelliyor ve taahhüt edilmemiş PAX7 miyogenik progenitörlerini sürdürüyor. eLife . 2020;12. makale RP87081 doi: 10.7554/eLife.87081. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
36.Thestrup T., Litzlbauer J., Bartholomäus I., ve diğerleri. Nöronların ve T lenfositlerin işlevsel in vivo görüntülenmesi için optimize edilmiş oranlı metrik kalsiyum sensörleri. Nature Methods . 2014;11(2):175–182. doi: 10.1038/nmeth.2773. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
37.Güttsches AK, Jacobsen F., Schreiner A., ve diğerleri. Sporadık inklüzyon gövdesi miyozitinde şaperonlar – proteomik verilerin doğrulanması. Kas ve Sinir. 2020;61(1):116–121. doi: 10.1002/mus.26742. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
38.Gallardo E., Saenz A., Illa I. Uzuv-kuşak kas distrofisi 2A. Klinik Nöroloji El Kitabı. 2011;101:97–110. doi: 10.1016/B978-0-08-045031-5.00006-2. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
39.Angelini C., Nardetto L., Borsato C., ve diğerleri. Kalpainopati (LGMD2A) ve disferlinopatinin (LGMD2B) klinik seyri Nörolojik Araştırma. 2010;32(1):41–46. doi: 10.1179/174313209X380847. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
40.Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna JA, Charpentier E. Uyarlanabilir bakteriyel bağışıklıkta programlanabilir çift RNA kılavuzlu DNA endonükleazı. Science . 2012;337(6096):816–821. doi: 10.1126/science.1225829. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
41.Mali P., Yang L., Esvelt KM, ve diğerleri. Cas9 aracılığıyla RNA kılavuzlu insan genom mühendisliği. Science . 2013;339(6121):823–826. doi: 10.1126/science.1232033. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
42.Arias-Fuenzalida J., Jarazo J., Qing X., ve diğerleri. FACS destekli CRISPR-Cas9 genom düzenlemesi Parkinson hastalığı modellemesini kolaylaştırır. Kök Hücre Raporları. 2017;9(5):1423–1431. doi: 10.1016/j.stemcr.2017.08.026. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
43.Eggenschwiler R., Moslem M., Fráguas MS, ve diğerleri. Cas9 nickazı tarafından hasta kaynaklı iPSC’de transkripsiyonel olarak sessiz bir lokusun iyileştirilmiş bi-allelik modifikasyonu. Bilimsel Raporlar . 2016;6(1, makale 38198) doi: 10.1038/srep38198. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
44.Gossen M., Freundlieb S., Bender G., Müller G., Hillen W., Bujard H. Memeli hücrelerinde tetrasiklinler tarafından transkripsiyonel aktivasyon. Science . 1995;268(5218):1766–1769. doi: 10.1126/science.7792603. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
45.Alexander MS, Rozkalne A., Colletta A., ve diğerleri. CD82, insan kas uydu hücrelerinin prospektif izolasyonu için bir belirteçtir ve kas distrofileriyle bağlantılıdır. Hücre Kök Hücre. 2016;19(6):800–807. doi: 10.1016/j.stem.2016.08.006. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
46.Charville GW, Cheung TH, Yoo B., ve diğerleri. İnsan kas kök hücrelerinin ex vivo genişlemesi ve in vivo kendini yenilemesi. Kök Hücre Raporları. 2015;5(4):621–632. doi: 10.1016/j.stemcr.2015.08.004. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
47.Garcia SM, Tamaki S., Lee S., ve diğerleri. İnsan uydu hücrelerinin yüksek verimli saflaştırılması, korunması ve seri nakli. Kök Hücre Raporları. 2018;10(3):1160–1174. doi: 10.1016/j.stemcr.2018.01.022. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
48.Pakula A., Spinazzola JM, Gussoni E. Moleküler Biyolojide floresanla aktive edilen hücre ayırma (FACS) Yöntemleri kullanılarak insan kasından miyojenik progenitörlerin saflaştırılması. 2019;1889:1–15. doi: 10.1007/978-1-4939-8897-6_1. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
49.Turan S., Farruggio AP, Srifa W., Day JW, Calos MP Uzuv kuşağı kas distrofisi olan hastalardan türetilen indüklenmiş pluripotent kök hücrelerde hastalık mutasyonlarının kesin olarak düzeltilmesi. Moleküler Terapi. 2016;24(4):685–696. doi: 10.1038/mt.2016.40. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
50.Selvaraj S., Dhoke NR, Kiley J., ve diğerleri. Hedeflenen otolog hücre tedavisinin geliştirilmesi için LGMD2A hastaya özgü iPSC’lerin gen düzeltmesi. Moleküler Terapi. 2019;27(12):2147–2157. doi: 10.1016/j.ymthe.2019.08.011. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makalesi ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
51.Mandal PK, Ferreira LMR, Collins R., ve diğerleri. CRISPR/Cas9 kullanılarak insan hematopoietik kök ve efektör hücrelerindeki genlerin etkili bir şekilde yok edilmesi. Hücre Kök Hücre. 2014;15(5):643–652. doi: 10.1016/j.stem.2014.10.004. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
52.Hallmann AL, Araúzo-Bravo MJ, Mavrommatis L., ve diğerleri. Mutant TAU proteininin neden olduğu frontotemporal demansın insan nöral kök hücre modelinde astrosit patolojisi. Bilimsel Raporlar . 2017;7(1, makale 42991) doi: 10.1038/srep42991. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
53.Fanin M., Fulizio L., Nascimbeni AC, ve diğerleri. LGMD2A’da moleküler tanı: mutasyon analizi mi yoksa protein testi mi? İnsan Mutasyonu. 2004;24(1):52–62. doi: 10.1002/humu.20058. [ DOI ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
54.Borchin B., Chen J., Barberi T. İnsan pluripotent kök hücrelerinden PAX3+/PAX7+ iskelet kası öncüllerinin türetilmesi ve FACS aracılı saflaştırılması. Kök Hücre Raporları. 2013;1(6):620–631. doi: 10.1016/j.stemcr.2013.10.007. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
55.Darabi R., Arpke RW, Irion S., ve diğerleri. İnsan ES ve iPS türevi miyojenik progenitörler distrofik farelerde DİSTROFİN’i geri kazandırır ve nakil sonrası kasılmayı iyileştirir. Hücre Kök Hücresi. 2012;10(5):610–619. doi: 10.1016/j.stem.2012.02.015. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
56.Magli A., Incitti T., Kiley J., ve diğerleri. PAX7 hedefleri, CD54, integrin α9β1 ve SDC2, insan ESC/iPSC türevi miyojenik progenitörlerin izolasyonuna izin verir. Hücre Raporları. 2017;19(13):2867–2877. doi: 10.1016/j.celrep.2017.06.005. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
57.Shelton M., Metz J., Liu J., ve diğerleri. İnsan ve fare embriyonik kök hücrelerinden PAX7 pozitif kas progenitörlerinin türetilmesi ve genişletilmesi. Kök Hücre Raporları. 2014;3(3):516–529. doi: 10.1016/j.stemcr.2014.07.001. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
58.Xi H., Langerman J., Sabri S., ve diğerleri. İnsan iskelet kası atlası, kök ve progenitör hücrelerin gelişim boyunca ve insan pluripotent kök hücrelerinden gelen yörüngelerini belirler. Hücre Kök Hücre . 2020;27(1):158–176.e10. doi: 10.1016/j.stem.2020.04.017. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
59.Marg A., Escobar H., Gloy S., ve diğerleri. İnsan uydu hücreleri rejeneratif kapasiteye sahiptir ve genetik olarak manipüle edilebilir. Klinik Araştırma Dergisi. 2014;124(10):4257–4265. doi: 10.1172/JCI63992. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]
60.Zhang Y., Nishiyama T., Olson EN, Bassel-Duby R. Kas distrofilerinin CRISPR/Cas ile düzeltilmesi. Deneysel Hücre Araştırması. 2021;408(1):p. 112844. doi: 10.1016/j.yexcr.2021.112844. [ DOI ] [ PMC ücretsiz makale ] [ PubMed ] [ Google Akademik ]