tren

Limb-Girdle Musküler Distrofi Tip 2E (LGMD2E) CAS9 CRİSPR

Limb-Girdle Musküler Distrofi Tip 2E (LGMD2E) CAS9 CRİSPR

Limb-Girdle Musküler Distrofi Tip 2E (LGMD2E) hastalığı için CRISPR-Prime Editing yöntemi kullanılarak preklinik moleküler tedavi geliştirilmesi

Proje Özeti

Limb-Girdle Musküler Distrofi (LGMD), iskelet kaslarını tutan, ilerleyici proksimal kas zayıflığı ile karakterize katılsal bir kas hastalığıdır.

LGMD hastalık grubu, kas zayıflığının dördüncü en yaygın sebebi olup hastalığın genel prevelansı 2.27-10/100.000’dır. LGMD çocukluk

veya erişkinlik çağında ortaya çıkmakta ve skapulohumeral ve/veya pelvifemoral kaslarda atrofi ile seyretmektedir. İlerleyen süreçte

hastaların hareketleri kısıtlanmakta ve yürüme yetileri tamamen kaybolmaktadır (Wicklund 2019). Hastalığın otozomal dominant

(LGMD1) ve otozomal resesif (LGMD2) kalıtımlı olarak aktarılan birçok tipi bulunmaktadır (Dincer, Leturcq et al. 1997, Dinçer, Akçören

et al. 2000, Balci, Wilichowski et al. 2004, Hara, Balci-Hayta et al. 2011, Taghizadeh, Rezaee et al. 2019). Otozomal resesif kalıtımlı

LGMD Tip 2E (LGMD2E), erken başlangıçlı ve nadir (0.86/10-6) bir LGMD tipi olup, beta-sarkoglikan (SGCB) genindeki mutasyonlar

sonucu ortaya çıkmaktadır (Fanin, Duggan et al. 1997, Dinçer, Akçören et al. 2000, Balci, Wilichowski et al. 2004, Guimarães-Costa,

Fernández-Eulate et al. 2021). Hastalık, şiddetli proksimal kas distrofisi ile karakterize olup hastaların yaklaşık yarısı 18 yaşından önce

yürüme yetisini kaybetmekte ve kardiyak tutulum göstermektedir (Semplicini, Vissing et al. 2015). LGMD2E için geliştirilmiş bir tedavi

henüz bulunmamaktadır, ancak preklinik aşamada başarı gösteren adeno-ilişkili virüs (AAV) aracılı beta-sarkoglikan gen aktarımı, faz

1/2 aşamasındadır (NCT03652259) (Pozsgai, Griffin et al. 2016, Pozsgai, Griffin et al. 2017). Bu çalışmalar, hastalığın gen tedavi

yöntemleriyle başarılı bir şekilde tedavi edilebileceğini önerse de AAV-aracılı gen aktarımının uzun vadede aşırı gen ifadesi sebebiyle

toksik etkiler oluşturabileceği gösterilmiştir (Van Alstyne, Tattoli et al. 2021). Bu sebeple, günümüzde hâlâ alternatif gen tedavi

metotlarına ihtiyaç duyulmaktadır. 2020 Nobel Kimya Ödülü’nün de verildiği metot olan CRISPR-Cas9-bazlı genom düzenleme

yöntemine dayanan hücre ve gen tedavi çalışmaları günümüzde gittikçe yaygınlaşmakta olup CRISPR teknolojisi kullanılarak

gerçekleştirilmiş hastalık tedavi çalışmaları ile ilgili umut verici veriler rapor edilmeye başlanmıştır (Xu, Wang et al. 2019, Frangoul,

Altshuler et al. 2020, Stadtmauer, Fraietta et al. 2020, Gillmore, Gane et al. 2021). Sunulan projenin amacı, LGMD2E hastalığına yol

açan mutasyonlardan birisi olan 32 baz çiftlik duplikasyonu (SGCB c.-22_10dup) taşıyan bir hasta bireyden elde edilerek oluşturulmuş

ölümsüz myoconverted fibroblast hücre hattında, CRISPR-Prime Editing yöntemi kullanılarak 32 bazın delesyonunun

gerçekleştirilmesiyle mutant allelin normal allele çevrilmesidir. Hastalık resesif kalıtımlı olduğundan hücrelerde tek bir allelin dahi

normal allele çevrilmesinin, beta-sarkoglikan ifadesini %50 artırarak kas işlevini iyileştirmek için yeterli olması beklenmektedir.

Miyotüplerde beta-sarkoglikan proteininin ifadesi ve yerleşimi western blot ve immünfloresan boyama yöntemleriyle incelenecektir.

CRISPR-Prime Editing ile muamele edilmiş hücreler, mutant ve kontrol grubu hücrelerle karşılaştırılıp genetik düzeltmenin protein

işlevine etkisi incelenmiş olacaktır. Çalışma, Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Biyoloji Ana Bilim Dalı laboratuvarında

gerçekleştirilecek olup araştırmada kullanılacak tüm teçhizat kurumumuzda mevcuttur. İş paketleriyle ilgili olası riskler ve bu risklerin

yönetimi proje dosyasında açıklanmıştır. Çalışmanın sonunda elde edilen veriler istatistiksel analizlerle değerlendirilecektir. Bu

çalışma ile, LGMD2E hastalığının tedavisine yönelik literatürde ilk defa genom düzenleme yöntemleri içinde en ileri teknolojilerden

biri olan CRISPR-Prime Editing metodu kullanılmış olacaktır (Anzalone, Randolph et al. 2019, Anzalone, Koblan et al. 2020, Matsoukas

2020). Ayrıca, bu çalışmadan elde edilen bilgiler LGMD2E hastalığının moleküler tedavisine yönelik in vivo çalışmalara öncü olacak

veriler sunacaktır

 

Kaynak: https://avesis.hacettepe.edu.tr/proje/98eca38c-790b-4165-86be-49f76fb13c94/limb-girdle-muskuler-distrofi-tip-2e-lgmd2e-hastaligi-icin-crispr-prime-editing-yontemi-kullanilarak-preklinik-molekuler-tedavi-gelistirilmesi

 

DİNÇER P. R. (Yürütücü), KURAL MANGIT E.GÜNTEKİN ERGÜN S.

2022 – 2023